Асёна (asena) wrote,
Асёна
asena

ПЦР в комиксах

Один преподаватель жалуется другому: "Представляешь, у меня такие непонятливые студенты!
Объясняю им материал - не понимают. Ещё раз объясняю - не понимают.
Третий раз объясняю, сам уже понял, а они все равно не понимают!"


Сегодня я хотела бы поговорить про ПЦР. То есть не то чтобы я так уж прямо хотела, но писать диплом я не хочу значительно сильнее.

Полимеразную цепную реакцию изобрел Кэри Мюллис. Когда ему в 1993 году дали за нее нобелевскую премию, он купил себе домик и стал писать художественную литературу, бороться за легализацию легких наркотиков и спорить с тем, что американцы были на Луне.

Полимеразная цепная реакция - это способ получить много такой ДНК, которая нужна.
Если, например, врач взял у вас мазок на сто тыщ клеток, и в этом мазке живет одна маленькая жалкая уреоплазмочка - эту маленькую жалкую уреоплазмочку с помощью ПЦР неминуемо найдут и начнут вас от нее лечить, в то время как до эпохи ПЦР-диагностики у нее были большие основания надеяться остаться незамеченной. Если, например, на вас напал враг, и вам удалось в неравном бою собрать от этого врага какой-нибудь биологический материал - ну хотя бы просто вырванный с корнем волос - потом с помощью метода ПЦР вы сможете совершенно неопровержимо доказать, что врагом был именно Вася Петров, как бы Вася Петров не старался убедить вас и присяжных, что врагом на самом деле был Петя Васильев. Если, например, вы планируете выйти замуж за очень консервативного и маложизнерадостного человека, и беспокоитесь - является ли его консервативность и нежизнерадостность следствием влияния среды или ранним симптомом хореи хантингтона - вы можете тихонечко уволочь его биологический материал в лабораторию и посмотреть, как у него насчет гена HD, сколько там у него CAG-повторов, все ли в порядке.
В общем, ПЦР - это очень удобный метод на все случаи жизни.


Вот примерно так устроена ДНК. Здесь важно то, что азотистые основания попарно комплементарны, т.е. аденозин ищет тимин, чтобы слиться с ним водородными связями, гуанин ищет цитозин, и когда они находят друг друга, они друг за друга хватаются и так живут.

Для того, чтобы выявить и размножить в имеющейся пробе именно ту последовательность ДНК, которая необходима, нужно знать нуклеотидные последовательности ее концов, для того, чтобы создать к ним комплементарные короткие (18-30 нуклеотидов) фрагменты - праймеры. На рисунке эти известные концы последовательности отмечены синим, а черным - тот фрагмент ДНК, который нужен.


Первая стадия - денатурация

Под воздействием температуры разрушаются водородные связи, и цепи ДНК расходятся.

Вторая стадия - отжиг.

Температуру снижают, и праймеры соединяются с комплементарными им участками ДНК.

Третья стадия - элонгация.

Полимераза - это фермент, умеющий достраивать вторую цепь ДНК. Для того, чтобы начать это делать, ей нужен кусочек, где ДНК уже двуцепочечная, в этом качестве и выступает место взаимодействия ДНК с праймером. Полимераза всегда достраивает цепь от 5' к 3'-концу (эти названия связаны с ориентацией сахара дезоксирибозы в цепи; в обычной двуцепочечной ДНК цепи направлены противоположно друг другу:
5'_____________3'
3'_____________5'

Теперь в растворе есть четыре слишком длинных цепи ДНК. Две - те, которые были, и две построенные по праймерам. Но если повторить процесс ещё раз, то получится следующая картина:

Если изначальные цепи ДНК можно было считать условно бесконечными в обе стороны, то нити, полученные в первом цикле, бесконечны в одну сторону, а со второй ограничены праймером. Когда такие цепи будут взаимодействовать со вторым праймером, будут получаться кусочки, ограниченные с двух сторон. Всего в ПЦР проводят несколько десятков циклов, поэтому абсолютное большинство продукта реакции будет представлять собой короткие нужные последовательности, с которыми уже можно будет производить различные манипуляции, в простейшем случае - разгонять на хроматографе и сравнивать полученные полоски с теми, которые должны были бы получиться, если бы была уреоплазма или если бы врагом был Вася Иванов.

Некоторые разновидности ПЦР
1. «Вложенная» ПЦР (Nested PCR) - есть вторая пара праймеров, которая амплифицирует кусочек полученного кусочка.
2. «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR) - перед проведением ПЦР с помощью серии ферментативных реакций как бы приклеивают известные фрагменты на концы неизвестного, чтобы можно было его амплифицировать.
3. ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - берется РНК (молекула, которая является промежуточным этапом между ДНК и белками в живой клетке), а из нее с помощью фермента обратной транскриптазы получают ДНК, с которой уже проводят ПЦР. Это удобно, например, для того, чтобы выявить, какие именно гены в данной клетке экспрессируются.
4. Ассиметричная ПЦР (Assymetric PCR) - если нужны продукты амплификации преимущественно одной из двух цепей ДНК. Добавляют неравное количество праймеров.
5. Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) - используются флуоресцентно меченые реагенты, и специальный прибор рассматривает пробирку, в которой идет реакция, и сообщает: "готово столько-то продукта! а теперь уже вдвое больше!"
6. ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) - чтобы амплифицировать длинный (больше 10 тысяч пар оснований) фрагмент, используют ПЦР с двумя полимеразами: одна из них, Taq-полимераза, может синтезировать длинную цепь, а вторая, ДНК-полимераза с 3'5'-экзонуклеазной активностью, может исправить ошибки, допущенные первой.
7. Multiplex PCR - добавляют несколько пар праймеров и одновременно амплифицируют несколько фрагментов.
Tags: био
  • Post a new comment

    Error

    default userpic

    Your reply will be screened

    Your IP address will be recorded 

  • 34 comments