Асёна (asena) wrote,
Асёна
asena

ПЦР в комиксах

Один преподаватель жалуется другому: "Представляешь, у меня такие непонятливые студенты!
Объясняю им материал - не понимают. Ещё раз объясняю - не понимают.
Третий раз объясняю, сам уже понял, а они все равно не понимают!"


Сегодня я хотела бы поговорить про ПЦР. То есть не то чтобы я так уж прямо хотела, но писать диплом я не хочу значительно сильнее.

Полимеразную цепную реакцию изобрел Кэри Мюллис. Когда ему в 1993 году дали за нее нобелевскую премию, он купил себе домик и стал писать художественную литературу, бороться за легализацию легких наркотиков и спорить с тем, что американцы были на Луне.

Полимеразная цепная реакция - это способ получить много такой ДНК, которая нужна.
Если, например, врач взял у вас мазок на сто тыщ клеток, и в этом мазке живет одна маленькая жалкая уреоплазмочка - эту маленькую жалкую уреоплазмочку с помощью ПЦР неминуемо найдут и начнут вас от нее лечить, в то время как до эпохи ПЦР-диагностики у нее были большие основания надеяться остаться незамеченной. Если, например, на вас напал враг, и вам удалось в неравном бою собрать от этого врага какой-нибудь биологический материал - ну хотя бы просто вырванный с корнем волос - потом с помощью метода ПЦР вы сможете совершенно неопровержимо доказать, что врагом был именно Вася Петров, как бы Вася Петров не старался убедить вас и присяжных, что врагом на самом деле был Петя Васильев. Если, например, вы планируете выйти замуж за очень консервативного и маложизнерадостного человека, и беспокоитесь - является ли его консервативность и нежизнерадостность следствием влияния среды или ранним симптомом хореи хантингтона - вы можете тихонечко уволочь его биологический материал в лабораторию и посмотреть, как у него насчет гена HD, сколько там у него CAG-повторов, все ли в порядке.
В общем, ПЦР - это очень удобный метод на все случаи жизни.


Вот примерно так устроена ДНК. Здесь важно то, что азотистые основания попарно комплементарны, т.е. аденозин ищет тимин, чтобы слиться с ним водородными связями, гуанин ищет цитозин, и когда они находят друг друга, они друг за друга хватаются и так живут.

Для того, чтобы выявить и размножить в имеющейся пробе именно ту последовательность ДНК, которая необходима, нужно знать нуклеотидные последовательности ее концов, для того, чтобы создать к ним комплементарные короткие (18-30 нуклеотидов) фрагменты - праймеры. На рисунке эти известные концы последовательности отмечены синим, а черным - тот фрагмент ДНК, который нужен.


Первая стадия - денатурация

Под воздействием температуры разрушаются водородные связи, и цепи ДНК расходятся.

Вторая стадия - отжиг.

Температуру снижают, и праймеры соединяются с комплементарными им участками ДНК.

Третья стадия - элонгация.

Полимераза - это фермент, умеющий достраивать вторую цепь ДНК. Для того, чтобы начать это делать, ей нужен кусочек, где ДНК уже двуцепочечная, в этом качестве и выступает место взаимодействия ДНК с праймером. Полимераза всегда достраивает цепь от 5' к 3'-концу (эти названия связаны с ориентацией сахара дезоксирибозы в цепи; в обычной двуцепочечной ДНК цепи направлены противоположно друг другу:
5'_____________3'
3'_____________5'

Теперь в растворе есть четыре слишком длинных цепи ДНК. Две - те, которые были, и две построенные по праймерам. Но если повторить процесс ещё раз, то получится следующая картина:

Если изначальные цепи ДНК можно было считать условно бесконечными в обе стороны, то нити, полученные в первом цикле, бесконечны в одну сторону, а со второй ограничены праймером. Когда такие цепи будут взаимодействовать со вторым праймером, будут получаться кусочки, ограниченные с двух сторон. Всего в ПЦР проводят несколько десятков циклов, поэтому абсолютное большинство продукта реакции будет представлять собой короткие нужные последовательности, с которыми уже можно будет производить различные манипуляции, в простейшем случае - разгонять на хроматографе и сравнивать полученные полоски с теми, которые должны были бы получиться, если бы была уреоплазма или если бы врагом был Вася Иванов.

Некоторые разновидности ПЦР
1. «Вложенная» ПЦР (Nested PCR) - есть вторая пара праймеров, которая амплифицирует кусочек полученного кусочка.
2. «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR) - перед проведением ПЦР с помощью серии ферментативных реакций как бы приклеивают известные фрагменты на концы неизвестного, чтобы можно было его амплифицировать.
3. ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - берется РНК (молекула, которая является промежуточным этапом между ДНК и белками в живой клетке), а из нее с помощью фермента обратной транскриптазы получают ДНК, с которой уже проводят ПЦР. Это удобно, например, для того, чтобы выявить, какие именно гены в данной клетке экспрессируются.
4. Ассиметричная ПЦР (Assymetric PCR) - если нужны продукты амплификации преимущественно одной из двух цепей ДНК. Добавляют неравное количество праймеров.
5. Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) - используются флуоресцентно меченые реагенты, и специальный прибор рассматривает пробирку, в которой идет реакция, и сообщает: "готово столько-то продукта! а теперь уже вдвое больше!"
6. ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) - чтобы амплифицировать длинный (больше 10 тысяч пар оснований) фрагмент, используют ПЦР с двумя полимеразами: одна из них, Taq-полимераза, может синтезировать длинную цепь, а вторая, ДНК-полимераза с 3'5'-экзонуклеазной активностью, может исправить ошибки, допущенные первой.
7. Multiplex PCR - добавляют несколько пар праймеров и одновременно амплифицируют несколько фрагментов.
Tags: био
Subscribe
  • Post a new comment

    Error

    default userpic

    Your reply will be screened

    Your IP address will be recorded 

    When you submit the form an invisible reCAPTCHA check will be performed.
    You must follow the Privacy Policy and Google Terms of use.
  • 34 comments